Kreatin-kinaza

CK (KREATIN-KINAZA) predstavlja enzim koji katalizuje fosforilaciju kreatina do fosfokreatina. Neophodan je u toku mišićne kontrakcije. Sastoji se iz dve subjedinice (mišićne – M i moždane – B) i ima tri izoenzima: CK-MM, CK-MB i CK-BB. Izoenzim CK-MM (CK-3) je karakterističan za skeletne mišiće, CK-BB (CK-1) za mozak, dok je izoenzim CK-MB (CK-2) najprisutniji u srčanom mišiću.

U krvnom serumu je normalno zastupljeno 95% CK-MM i 5% CK-MB. Udeo CK-MB veći od 5% u ukupnoj aktivnosti CK ukazuje na oštećenje srčanog mišića.
– Porast CK se javlja se 3-6 sati nakon početka akutnog infarkta.
– Maksimum doseže nakon 24 sata.
– Normalizuje se nakon 3-4 dana.

CK-BB nije normalno prisutan u serumu. Ovaj izoenzim se pojavljuje u serumu usled povrede mozga, kancera prostate, bubrega ili kancera pluća.

Princip određivanja:
CK
ADP + kreatin fosfat ————–→ kreatin + ATP
heksokinaza
ATP + glukoza —————→ ADP + glucozo-6-fosfat (G6P)
G6P dehidrogenaza
G6P + NAD+ —————————-→ 6-Phosphogluconate + NADH + H+

Indikator u ovoj metodi je NADH. Porast apsorbancije je proprcionalan aktivnosti kreatin-kinaze. Metoda je kinetička.

Advertisements

Alfa amilaza

Alfa amilaza je enzim koji u organizmu ima ulogu u varenju složenih ugljenih hidrata – hidrolizuje skrob (amilozu i amilopektin, koji su sačinjavaju skrob), cepajući α 1-4 glikozidne veze. Razlikujemo 2 tipa (izoenzima) α-amilaze:

  1. pljuvačnu (salivarnu) α-amilazu, označavamo je kao S-tip, koju luče pljuvačne žlezde i koja razgrađuje skrob u ustima,  i
  2. pankreasnu α-amilazu, označavamo je kao P-tip koju luči pankreas, a koja se izlučuje u tanko crevo gde razgrađuje ugljene hidrate.

Kod čoveka se nalazi u velikom broju organa i tkiva, ali najveći deo potiče iz pankreasa, a nešto manji iz u pljuvačnih žlezda.. Alfa amilaza je male molekularne mase, zbog čega je normalno prisutna u urinu u odsustvu oboljenja bubrega. Amilaza u svom molekulu sadrži jon kalcijuma, koji stabilizuje sam enzim. Joni hlora aktiviraju amilazu.

Amilaza je povišena u serumu i urinu kod obolelih od različitih bolesti, a najčešće se određuje kod sumnje na akutni pankreatitis, gde posle napada vrednosti rastu nakon 6-48 sati, a ostaju povišene 3-5 dana, uz uobičajeno četvorostruko do šetostruko povećanje vrednosti. Osim u ovom slučaju, povišene vrednosti se sreću i kod hroničnog pankreatitisa, karcinoma pankreasa, bolesti pljuvačnih žlezda (mumps), a mogu biti povišene i kod bolesti bilijarnog trakta (holecistitis, holangitis, holelitijaza), perforacije čira na želucu, intestinalnoj opstrukciji (ileus), uremiji i u postoperativnim stanjima.

Makroamilazemija – benigno stanje, najčešće bez simptoma u kome su vrednosti α-amilaze povišene 6-8 puta.  Dešava se usled vezivanja amilaze za imunoglobuline (IgA ili IgG), zbog čega je usled veličine kompleksa onemogućeno filtriranje α-amilaze kroz bubrege i njeno izlučivanje iz organizma. Vrednosti  u urinu su posledično snižene.

Snižene vrednosti amilaze mogu se naći kod uznapredovale cistične fibroze, ozbiljnog oštećenja jetre i pankreatektomije.

Određivanje

U metodama za određivanje katalitičke koncentracije amilaze u serumu i mokraći koriste se prirodni (skrob, amiloza) ili veštački supstrati (p-nitrofenilni i hlor-p-nitrofenilni maltozidi).

Skrob i jod grade kompleks plave boje. Nakon delovanja α amilaze, dolazi do smanjenja intenziteata boje zbog hidrolize skroba, pa je moguće odrediti katalitičku koncentraciju enzima na osnovu razlika u obojenosti kompleksa skrob-jod pre i posle delovanja enzima.

Problem sa skrobom je  što ne može da se primpremi u formi definisanog i reproducibilnog kvaliteta, a hidroliza amilazom se ne odigrava po zakonu jednostavnog stehiometrijskog odnosa, iz čega proizilazi niska osetljivost i loša preciznost. Zato su danas više u upotrebi mali oligosaharidi (maltotrioza, maltotetroza i maltopentoza) koji se odlikuju dobrom stabilnošću i uniformnim proizvodima hidrolize.

Jedna od metoda je metoda u kojoj se kao supstrat koristi 2-hloro-4-nitrofenilmaltotriozid, na koji direktno deluje α amilaza, vršeći hidrolizu, pri čemu se izdvaja  obojeni 2-hloro-4-nitrofenol, zbog čega dolazi do povećanja apsorbancije. Promena apsorbancije po minutu je direktno proporcionalna aktivnosti enzima.

Primer uputstva za upotrebu reagensa:

http://www.standard.com.tw/standard/t_standard/system_manager/tw/products/uploadFile/55/En-amyli(AMYLASE).pdf

Laktat dehidrogenaza, LDH

Laktat dehidrogenaza (LDH) je oksidoreduktaza koja katalizuje oksidaciju laktata u piruvat koristeći NAD+ kao akceptor vodikovih jona. Reakcija je reverzibilna i kod fiziološkog pH favorizirana je redukcija piruvata u laktat.

LDH se određuje u sledećim slučajevima:

–      infarkt miokarda i njegovo praćenje

–      plućna embolija

–      diferencijacija žutice

–      hemolitička anemija

–      dijagnoza oštećenja određenih organa (kvantitativnom analizom izoenzima)

–      dijagnoza i praćenje malignih bolesti

LDH je prisutna u različitim količinama u citoplazmi svih ćelija organizma.

Smanjena koncentracija laktat dehidrogenaze nema kliničkog značenja.

Najčešći uzroci povišenja LDH su bolesti jetre, srca i skeletnih mišića. Ukupni LDH nije marker oštećenja specifičnog organa. Ipak, ako je ukupna LDH povišena, kvantitativno  određivanje izoenzima može omogućiti  dijagnostički korisnu informaciju vezanu za pojedini organ.

LDH se sastoji se od 4 polipeptidna lanca koji pripadaju tipu H (heart) i M (muscle). Razlikujemo pet izoenzima, koji su specifični za određeni organ.

LD1 – H4          srce i eritrociti

LD2 – H3M1    retikuloendotelni sistem

LD3 – H2M2    pluća, slezena, limfni čvorovi

LD4 – H1M3    bubreg, posteljica, pankreas

LD5 – M4          jetra, poprečno prugasti mišići

Različiti izoenzimi imaju različito vreme poluraspada, pa se različito dugo mogu pratiti u krvi. Izoenzimi se mogu razdvojiti elektroforezom jer imaju različitu elektroforetsku pokretljivost. Izoenzimi koji sadrže H podjedinice putuju brže, dok izoenzimi koji sadrže M podjedinice putuju sporije   à LDH1 putuje najbrže, a LDH5 najsporije.

Povećana aktivnost izoenzima:

—        LD1 i LD2  infarkt miokarda, hemoliza, mišićna distrofija, infarkt bubrega

—        LD4 i LD5  bolesti jetre, oštećenje skeletnih mišića, maligne bolesti

—        LD3  destrukcija trombocita, limforetikularne bolesti, oštećenje slezene, maligni tumori

Određivanje ukupne aktivnosti LDH spektrofotometrijski

Određivanje se zasniva na primenni osnovne reakcije koju katalizuje LDH:

Pyruvate_to_lactate

U reakciji se meri promena apsorbancije NADH. U slučaju da je u reagensu laktat, beleži se porast apsorbancije, a ako je u reagensu piruvat, beleži se pad apsorbancije na 340 nm (Warburgov optički test).

Transaminaze (AST i ALT)

Transaminaze ili aminotransferaze su enzimi koji katalizuju reakcije između aminokiselina i alfa-ketokiselina. Ova reakcija podrazumeva prenos amino grupe sa aminokiseline na α-ketokiselinu, pri čemu iz ketokiseline nastaje aminokiselina. Ova reakcija omogućava telu da stvara određene vrste aminokiselina. Transaminaze kao koenzim koriste piridoksal-fosfat (dobija se iz vitamina B6, služi za prenos amino grupe), koji u prvoj fazi reakcije prelazi u piridoksamin. Piridoksamin vezan za enzime reaguju se piruvatom, oksalacetatom ili alfa-ketoglutaratom, pri čemu nastaju alanin, asparaginska kiselina ili glutaminska kiselina.

Aspartat-aminotransferaza (AST) = glutamat-oksalacetat transaminaza (GOT)

Ovaj enzim katalizuje sledeću hemijsku reakciju:

L-aspartat + 2-oksoglutarat ↔ oksaloacetat + L-glutamat

AST  je enzim čija se aktivnost određuje u krvi u dijagnozi, razlikovanju i praćenju bolesti jetre i žuči, infarktu miokarda i oštećenju skeletnih mišića.

Ovaj enzim ima dva izoenzima: citoplazmatski (40%) i mitohondrijalni (60%). Pri manjim oštećenjima se oslobađa samo citoplazmatski, a u većim i mitohondrijalni enzim.

Vrednosti su izrazito povišene u akutnom hepatitisu (20-30 puta), umereno povišene kod hroničnog hepatitisa. Izrazito povišene vrednosti se sreću i kod akutne mononukleoze u kojoj maksimum dostižu krajem druge nedelje.

Alanin-aminotransferaza (ALT) = glutamat-piruvat transaminaza (GPT)

Ovaj enzim katalizuje sledeću hemijsku reakciju:

L-alanin + 2-oksoglutarat  piruvat + L-glutamat

ALT je citoplazmatski i specifični jetreni enzim (ima ga značajno više nego u drugim organima). Aktivnost ovog enzima u serumu je zančajno povećana u akutnim bolestima jetre, dok u hroničnim bolestima jetre (npr. hronični hepatitis) vrednosti ALT mogu biti samo blago povećane ili čak u granicama normale. Povećane vrednosti se sreću još u akutnoj mononukleozi.

Odnos između AST i ALT se naziva De Ritisov koeficijent. Kod blažih oštećenja AST/ALT<0,7 jer u tom slučaju dolazi do izlivanja citoplazmatskih enzima (АST je manje prisutan u citoplazmi nego u mitohondrijama, pa  je  i odnos manji). Odnos AST/ALT>0,9 ukazuje na lošu prognozu – označava da je došlo do većeg izlivanja mitohondrijalnog izoenzima AST, tj. da su nastupila značajnija oštećenja ćelija.

Određivanje:

Određivanje AST se zasniva na dve reakcije. Prva reakcija je merna jer u njoj učestvuje analit koji treba da izmerimo (AST), a druga reakcija je indikatorska, jer u njoj učestvuje ili se stvara indikator, koji nam omogućava merenje.

U prvoj reakciji se aspartat pretvara u oksalacetat (u prisustvu α-ketoglutarata iz koga nastaje glutamat). Ovu rekciju katalizuje AST. Nastali oksalacetat se uključuje u drugu reakciju koju katalizuje malatdehidrogenaza (MDH). Od oksalacetata se redukcijom dobija L-malat. Ovo je rakcija u kojoj učestvuje koenzim NADH, koji se pretvara u NAD+. NADH apsorbuje svetlost na 340nm, dok NAD ne apsorbuje (Warburgov optički test), zbog čega dolazi do pada apsorbancije. Brzina pada apsorbancije je proporcionalana aktivnosti AST.

malasp

Određivanje ALT se zasniva na veoma sličnom principu, kao i AST. U prvoj reakciji se alanin pretvara u piruvat (u prisustvu α-ketoglutarata iz koga nastaje glutamat). Ovu rekciju katalizuje ALT. Nastali piruvat se uključuje u drugu reakciju koju katalizuje laktakdehidrogenaza (LDH). U ovoj rekciji od piruvata nastaje laktat (so mlečne kiseline). Ovo je rakcija oksidoredukcije u kojoj učestvuje koenzim NADH, koji se pretvara u NAD+. NADH apsorbuje svetlost na 340nm, dok NAD ne apsorbuje (Warburgov optički test), zbog čega dolazi do pada apsorbancije. Brzina pada apsorbancije je proporcionalana aktivnosti ALT

.gptdiag

Pyruvate_to_lactate

Alkalna fosfataza

Alkalna fosfataza spada u grupu hidolaza. Ovo je grupno-specifični enzim koji katalizuje hidrolizu monoestra fosfatne kiseline (nukleotida, proteina…) i alkohola.

Fosfat-monoestar + H2O → alkohol + fosfat

Optimalni pH za delovanje enzima je između 9.8 i 10.5, a zavisi od vrste supstrata i vrste pufera. Pošto pokazuje najjaču aktivnost u alkalnom području, zato se i naziva alkalna fosfataza. Mg2+ i Zn2+ su joni neophodni za delovanje ovog enzima, dok Ca2+ i fosfat sprečavaju njegovo delovanje.

Enzim je prisutan najviše u epitelu tankog creva, bubrežnim tubulima, kostima, jetri, placenti i leukocitima. ALP u serumu zdravih odraslih osoba uglavnom potiče iz jetre, a u serumu dece i iz kostiju, a kod trudnica iz placente. Razlikujemo tri izoenzima: intestinalna ALP, placentarna ALP i ALP iz kostiju, jetre i bubrega.

Povišene vrednosti mogu da ukazuju na povećanu razgradnju kostiju i na mogući razvoj osteoporoze, na bolesti kostiju (osteosarkom, metastaze, hiperparatireiodizam, Padžetova bolest). Karakteristično je povišenje u slučajevima postojanja opstrukcije sekrecije žuči. Osim toga i druge bolesti jetre mogu dovesti do povišenja nivoa ALP: ciroza, karcinom jetre… Neka oboljenja poput Hodgkinove bolesti, kongestije srca i ulcerativnog kolitisa daju umereno povišene vrednosti ALP-a u serumu.

Povećane vrednosti pokazuju da se proces razgradnje i izgradnje kostiju odvija „punom parom“, što je normalno samo u detinjstvu ili nakon preloma. Takođe, ALP je fiziološki povišen kod trudnica u trećem trimestru trudnoće. Snižene vrednosti ovog enzima se sreću kod: pothranjenosti, nedostatka belančevina, kod bolesnika na dijalizi, hipotiroidizma, nedostatka vitamina B12, cinka i magnezijuma.

Određivanje:

Kao i najveći broj drugih enzima, aktivnost alkalne fosfataze se određuje spektrofotometrijski kinetičkom metodom na osnovu reakcije u kojoj ALP hidrolizuje p-nitrofenilfosfat (pNPP), pri čemu se oslobađa fosfat i obojeni p-nitrofenol (pNP). Aktivnost ALP je proporcionalna brzini nastanka pNP. U rekciju se može uvesti molekul koji će prihvatati fosfat, čime dolazi do ubrzavanja reakcije. Najčešće je to 2-amino-2-metil-1-propanol (AMP).

pNPP + H2O ↔ pNP + fosfat

sa akceleratorom:  pNPP + AMP ↔ pNP + AMP-PO4

reakcija ALP